漢景帝三年(公元前154年),吳、楚等國反叛。周亞夫以中尉代行太尉的職務，率領軍隊向東攻打吳、楚。他向景帝請示說：“吳、楚的軍隊兇悍迅猛，一時難以同他們正面交鋒。我希望暫時聽任他們進攻梁國不管，而派兵去斷絕他們的糧道，這樣才可以制服他們。”景帝同意了他的意見。
周亞夫調集軍隊到達滎陽后，吳國軍隊正在進攻梁國，梁國局勢危急，請求救援，亞夫卻領軍隊向東北急行軍到達昌邑(古縣名，治今山東金鄉(xiāng)西北),深挖溝高筑壘進行防守。梁國每天派使者請求太尉救援，但亞夫堅守自己有利的形勢，不肯前往救援。梁國無奈便上書給景帝，景帝親自派使臣來命令太尉去救援梁國，亞夫仍然拒不執(zhí)行皇帝的詔令，堅守營壘不出兵，而派弓高侯韓穨當?shù)热寺暑I輕騎兵斷絕吳、楚軍隊后方的糧道。吳國的軍隊缺糧，饑餓難忍，多次挑戰(zhàn)，周亞夫始終不出來應戰(zhàn)。一天夜里，亞夫軍中突然受到驚擾，以至于互相攻擊，一直鬧到太尉的營帳底下。亞夫始終高臥不起，像沒事一樣。過了一會，營中也就又恢復安定了。后來吳軍奔襲漢軍營的東南角，亞夫卻叫大家戒備西北方向。不久，吳國的精兵果然奔襲西北，但漢軍早有防備，無法攻入。吳國軍隊受饑挨餓，只得引軍撤退。亞夫派出精兵追擊，大破吳軍。吳王劉濞丟掉他的大部隊，只帶著幾千名精壯的親兵逃去，退守到江南的丹徒縣(治今江蘇鎮(zhèn)江東丹徒鎮(zhèn))。漢軍乘勝追擊，把敵兵全部俘虜了，又懸賞千斤黃金捉拿吳王。一個多月以后，東越人便斬了吳王的頭前來報告。這次平叛，從防守到反攻，總共只用了3個月時間，吳楚叛亂便被徹底平定了。這時，將領們才領會到太尉周亞夫的計策是完全正確的。
回到京城以后，朝廷正式任命周亞夫為太尉。5年以后升為丞相。景帝很器重他。